AAT Bioquest 比色β-半乳糖苷酶测定试剂盒

AAT Bioquest  12604  Amplite® Colorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit 200 Tests 

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美国AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家为从事生命科学研究、诊断研发及药物开发的科学家研发、生产和销售生物分析研究试剂和试剂盒的公司。公司致力于光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术。AAT Bioquest的产品帮助quan世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学，免疫学，细胞生物学和分子生物学等领域。AAT Bioquest会不断介绍新产品，快速的丰富各个领域的产品。

 AAT Bioquest 比色β-半乳糖苷酶测定试剂盒

AAT Bioquest 12604 Amplite® Colorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit 200 Tests，产品简介：

产品品牌：AAT Bioquest

产品货号：12604

产品名称：Amplite®比色β-半乳糖苷酶测定试剂盒

英文名称：Amplite® Colorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit

产品规格：200 Tests

产品说明：

大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一种464 kD四聚体。β-半乳糖苷酶的每个单位由五个结构域组成，其中第三个是活性位点。它是细胞中必需的酶。这种酶的缺乏可导致半乳唾液酸病或Morquio B综合征。在大肠杆菌中，β-半乳糖苷酶由LacZ操纵子的活化产生。LacZ表达的检测已成为常规，每个细胞只需检测5个拷贝的β-半乳糖苷酶。该试剂盒使用显色半乳糖苷酶底物，可以灵敏地区分 LacZ+ 和 LacZ- 细胞。浅黄色底物与半乳糖苷酶反应时生成强紫色产物。它既可用于检测 ELISA 型测定系统中的半乳糖苷酶偶联物，也可用于监测细胞中的 LacZ 基因表达。Amplite® 比色 β-半乳糖苷酶检测试剂盒随附所有基本成分和优化的检测方案。它可用于筛选半乳糖苷酶抑制剂或诱导剂。

平台

吸光度酶标仪

吸光度 580/460 纳米

推荐板 清除底部

组件

组分A：Resorufinβ-D-半乳糖苷 1瓶

组分B：反应缓冲液 1 瓶 （20 mL）

组件 C：停止缓冲区 1 瓶 （10 mL）

组分D：裂解缓冲液 1 瓶 （10 mL）

构成部分E：DMSO 1 瓶 （100 μL）

组分F：β-巯基乙* 1 瓶 （100 μL）

示例协议

一目了然

协议摘要

1. 用LacZ基因制备稳定或瞬时转染的细胞

2. 用测试化合物孵育细胞（样品）

3. 裂解细胞

4. 将裂解物转移到微量滴定板上

5. Add FDG working solution

6. 根据细胞类型在室温或 37°C 下孵育至少 5 分钟

7. 添加停止解决方案

8. 测量 580 nm 至 460 nm 波长处的 OD 比（Ab580/血型460)

重要注意事项

使用前将所有套件组件解冻至室温。

储备液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。

1. Resorufinβ-D-半乳糖苷酶储备溶液（200X）：

将50μLDMSO（组分E）加入到β-D-半乳糖苷酶（组分A）的小瓶中，制成200X间苯卤灵β-D-半乳糖苷酶储备溶液。注意：25 μL 该储备溶液足以用于一个 96 孔板。避光保存。

标准溶液的制备

β-半乳糖苷酶标准品

可选（如果需要标准曲线）：用0.3%β-巯基乙*测定缓冲液制备β-半乳糖苷酶（大肠杆菌）标准品的连续稀释液。将标准曲线上每个点的 50 μL 等分试样转移到板的对照孔中。β-半乳糖苷酶的最高推荐量为 200 mU/mL （200 - 400 ng）。建议对由 1 个点组成的标准曲线进行 3：8 连续稀释。注意：调整标准曲线以适应特定的实验条件，例如细胞类型、数量、转染效率和培养板的大小。每次进行测定时，必须新鲜制备标准曲线的稀释液。

工作溶液的制备

1. 0.3 % β-巯基乙*测定缓冲液：

将 30 μL β-巯基乙*（组分 F）加入 10 mL 反应缓冲液（组分 B）中，并充分混合。注意：制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液，用于生成标准曲线。

2. ResorufinβDG工作溶液：

将25 μLResorufinβ-D-半乳糖苷酶储备溶液（200X）加入5 mL 0.3%β-巯基乙*测定缓冲液中。注意：该工作解决方案足以用于一个 96 孔板。

3. 裂解缓冲液工作溶液：

使用前将 5 μL β-巯基乙*（组分 F）加入 5 mL 裂解缓冲液（组分 D）中。注意：在裂解细胞之前，始终将0.1%β-巯基乙*加入裂解缓冲液中

实验方案样本

表 1.推荐的细胞培养板裂解缓冲液工作溶液体积。

培养板类型 裂解缓冲液工作溶液（μL/孔）

96孔板 50

24孔板 250

12孔板 500

6孔板 1000

60 mm 板 2000

100 mm 板 4000

制备哺乳动物细胞的细胞提取物

1. 用测试化合物处理含有LacZ基因的细胞一段时间。

2. 用1X PBS洗涤细胞两次。不要移开细胞。

3. 用裂解缓冲液工作溶液相应地裂解细胞。

对于贴壁细胞：将裂解缓冲液工作溶液添加到培养板中。有关建议的卷，请参见表 1。

对于非贴壁细胞：将细胞沉淀到离心管中，并向管中加入 50 - 2000 μL（取决于细胞沉淀的大小）裂解缓冲液工作溶液。

4. 将上一步的细胞在室温下孵育10-15分钟，并轻轻旋转板或试管数次以确保wan全裂解。

5. 进行β-半乳糖苷酶测定或将样品冷冻在-80°C直至使用。注意：良好的裂解也可以通过快速冻融循环获得（在-1°C至-2°C下冷冻20-80小时，在室温下解冻）。或者，将细胞裂解液离心2-3分钟以沉淀不溶性物质，然后测定上清液。

运行 β-半乳糖苷酶测定

1. 如果需要，在室温下解冻裂解细胞的管或板。如果将细胞接种在96孔板中，则直接在96孔板上进行测定。

2. 将 50 μL 细胞提取物加入 96 孔板的每个孔中。如果需要标准曲线，请为标准曲线（50 uL/孔）保存一些对照孔。注意：如有必要，当转染效率非常高时，将裂解液稀释在裂解缓冲液工作溶液中，或在转染效率低时减少裂解缓冲液的体积。如果在96孔板中进行转染，或者将稳定的细胞系接种到96孔板中，则直接在板上进行测定。对于内源性β-半乳糖苷酶活性控制，从未转染的细胞中加入 50 μL 细胞裂解物。对于空白对照，加入 50 μL 裂解缓冲液工作溶液。

3. 向每个孔中加入 50 μL ResorufinβDG 工作溶液。根据细胞类型，将板在室温或 37°C 下孵育约 10 分钟至 4 小时。

4. 向每个孔中加入 50 μL 终止缓冲液（组分 C）。

5. 通过测量580nm至460nm波长处的OD比（Ab580/血型460）使用吸光度酶标仪。

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