AAT Bioquest mFluor™ Violet 450 maleimide

AAT Bioquest1600  mFluor™ Violet 450 maleimide 1mg 

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美国AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家为从事生命科学研究、诊断研发及药物开发的科学家研发、生产和销售生物分析研究试剂和试剂盒的公司。公司致力于光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术。AAT Bioquest的产品帮助quan世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学，免疫学，细胞生物学和分子生物学等领域。AAT Bioquest会不断介绍新产品，快速的丰富各个领域的产品。

AAT Bioquest1600 mFluor™ Violet 450 maleimide 1mg，产品简介：

产品品牌：AAT Bioquest

产品货号：1600

产品名称：mFluor™ Violet 450 maleimide

产品规格：1mg

 AAT Bioquest  mFluor™ Violet 450 maleimide 

产品说明：

mFluor™染料专为多色流式细胞术应用而开发。这些染料具有较大的斯托克斯位移，并且可以被流式细胞仪的激光线（例如，405 nm、488 nm和633 nm）很好地激发。mFluor™ Violet 450染料的荧光激发和发射最大值分别为~405 nm和~450 nm。这些光谱特性使其成为太平洋蓝™标记染料的jue佳替代品。mFluor™ Violet 450马来酰亚胺稳定，与硫醇基团具有良好的反应性和选择性。mFluor™ Violet 450马来酰亚胺提供了一种方便的工具，用于标记单克隆、多克隆抗体或其他蛋白质（>10 kDa），用于使用紫色激光激发的流式细胞术应用。

示例协议

储备溶液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。

1. mFluor™ Violet 450 马来酰亚胺储备溶液（溶液 B）

将无水DMSO加入mFluor™ Violet 450马来酰亚胺的小瓶中，制成10 mM储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。

注意 在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）。请及时使用。延长染料储备溶液的储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和潮湿的情况下可以在冰箱中储存长达4周。避免冻融循环。

2. 蛋白质储备溶液（溶液A）

将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~100.6 的 0 mM MES 缓冲液）与 900 μL 目标蛋白溶液（例如抗体、蛋白浓度>如果可能，为 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白标记储备液。

注意蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。

注意 不纯抗体或用牛血清白蛋白 （BSA） 或其他蛋白质稳定的抗体不会很好地标记。

注意 如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，则偶联效率会显着降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

可选：如果您的蛋白质不含游离半胱an酸，则必须用DTT或TCEP处理蛋白质以产生硫醇基团。DTT或TCEP用于将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用DTT，则必须在将染料马来酰亚胺与蛋白质偶联之前，通过透析或凝胶过滤去除游离DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例协议：

在蒸馏水中制备 1 M DTT（15.4 mg/100 μL）的新鲜溶液。

在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液：混合时每 ml IgG 溶液加入 20 μL DTT 原液。在室温下静置 30 分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱an酸对胱an酸的再氧化）。

将还原的IgG通过用“交换缓冲液"预平衡的过滤柱。从色谱柱上收集 0.25 mL 馏分。

确定蛋白质浓度并将馏分与大部分IgG合并。这可以通过分光光度法或比色法完成。

在此步骤之后尽快进行偶联（参见示例实验方案）。

注意 IgG 溶液应为 >4 mg/mL 以获得最佳结果。如果抗体浓度低于 2 mg/mL，则应进行浓缩。在缓冲液交换柱上包括额外的10%的损失。

注意 还原可以在pH为7-7.5的几乎任何缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。

注意 步骤 3 和 4 可以用透析代替。

实验方案样本

该标记方案是为山羊抗小鼠IgG与mFluor™ Violet 450马来酰亚胺的偶联物开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。

注意每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物会降低灵敏度。

运行偶联反应

1. 使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比为 10：1 作为起点：将 5 μL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）加入蛋白质溶液（95 μL 溶液 A）的小瓶中，有效摇匀。假设蛋白质浓度为0mg / mL，蛋白质的分子量为~05KD，蛋白质的浓度为~10.200mM。

注意 我们建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10：1。如果太少或太高，请分别以 5：1、15：1 和 20：1 确定最佳染料/蛋白质比例。

2. 继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

纯化偶联

以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化的染料-蛋白质偶联物的示例。

1. 根据制造说明制备Sephadex G-25色谱柱。

2. 将反应混合物（来自“运行共轭反应"）加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。

3. 一旦样品刚好在顶部树脂表面下方运行，就加入PBS（pH 7.2-7.4）。

4. 向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的级分。

注意 为了立即使用，染料-蛋白偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分用于多次使用。

注意 对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

  AAT Bioquest  mFluor™ Violet 450 maleimide 

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