AAT Buccuite™快速蛋白质交联试剂盒

AAT Bioquest1315 Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction* 

我们北京云肽生物科技有限公司作为AAT Bioquest公司的特约经销商为客户提供，正规进口，保证原装正品，货期稳定，折扣好的服务标准。

美国AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家为从事生命科学研究、诊断研发及药物开发的科学家研发、生产和销售生物分析研究试剂和试剂盒的公司。公司致力于光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术。AAT Bioquest的产品帮助quan世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学，免疫学，细胞生物学和分子生物学等领域。AAT Bioquest会不断介绍新产品，快速的丰富各个领域的产品。

 AAT Buccuite™快速蛋白质交联试剂盒

AAT Bioquest1315 Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction*，产品简介：

产品品牌：AAT Bioquest

产品货号：1315

产品名称：Buccuite™快速蛋白质交联试剂盒

英文名称：Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction*

产品规格：2 Labelings

产品说明：

蛋白质-蛋白质偶联通常使用双功能接头（如 SMCC）进行。SMCC的一端（通过NHS酯）与氨基酸赖氨酸和N-末端中的胺（-NH2）反应，另一端（通过马来酰亚胺）与氨基酸半胱an酸中的硫醇基团（-SH）反应。然而，SMCC修饰的蛋白质极不稳定且经常自反应，因为蛋白质通常含有胺和硫醇基团，导致大量的同源交联。此外，量化蛋白质上马来酰亚胺基团的数量是相当困难和乏味的。亚洲空运中心生物探索开发了一种方便有效的交联方法，以高偶联率连接两种生物分子。我们的方法使用一对交联剂：Buccutite MTA和Buccutite™™ FOL.MTA被添加到一种蛋白质中，而FOL被添加到另一种蛋白质中。蛋白质-蛋白质交联反应是通过混合蛋白质-1-颊铁矿MTA和蛋白质-2-颊铜矿™ ™ FOL引发的。这种交联反应在极其温和的中性条件下发生，无需任何催化剂，并且稳定而高效。

组件

组件 A：钝石™ MTA 2 瓶（冻干）

组分 B：钝化石™ FOL 2 瓶（冻干）

组分C：反应缓冲液 1 瓶 （50 μL）

组件D：离心柱 4 列

示例协议

一目了然

协议摘要

1. 准备蛋白质溶液

2. 运行蛋白-1 颊铁矿™ MTA 反应

3. 运行蛋白-2 颊铁矿™ FOL 反应

4. 通过在室温下混合和孵育来交联蛋白-1和蛋白-2反应

重要

收到后，将组件A和B储存在-20°C。 如果储存得当，试剂盒应稳定保存六个月。不要冷冻反应缓冲液（组分C）和离心柱（组分D）。加热所有组件并在打开小瓶之前短暂离心。在开始偶联之前，请立即准备必要的溶液。以下SOP是将100μg蛋白质-1与蛋白质2偶联的示例。

注意： 实现最佳性能的关键参数：

1. 蛋白质分子量：>100，000道尔顿

2. 蛋白质浓度：>= 1毫克/毫升

3. 蛋白质样品体积：60~120 μL

工作溶液的制备

蛋白质工作溶液

为了标记 100 μg 蛋白质-1 和蛋白质-2（假设两种蛋白质的浓度为 1 mg/mL），请将 5 μL（占总反应体积的 5%）反应缓冲液（组分 C）与 100 μL 每种蛋白质溶液混合。

注意： 蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果将其溶解在甘an酸缓冲液中，则必须用1X PBS，pH 7.2-7.4进行透析，或使用ReadiUse™ 10KD旋转过滤器（AAT Bioquest的货号60502）去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如**铵和醋酸铵）。

实验方案样本

运行蛋白 1-颊铁矿™ MTA 反应

1. 将 105 μL 蛋白质-1 溶液直接加入 Buccutite ™ MTA（组分 A）小瓶中，并通过反复移液几次或涡旋小瓶几秒钟来充分混合。

2. 将蛋白质-1-颊铁矿™ MTA反应混合物在室温下保持30-60分钟。如果需要，蛋白质-颊铁矿™ MTA反应混合物可以旋转或摇动更长的时间。

3. 通过脱盐柱纯化蛋白质-1-颊铁矿™ MTA。有关详细操作，请参阅“制备用于蛋白质纯化的离心柱"部分。

4. 计算脱盐后产率为1%的蛋白质-75-颊铁矿™ MTA的浓度。（例如：如果从100μg蛋白质开始，脱盐柱纯化后，回收蛋白量为~75μg。

运行蛋白 2-颊铁矿™ FOL 反应

1. 将 105 μL Protein-2 溶液直接加入 Buccutite ™ FOL 小瓶（组分 B）中，并通过重复移液几次或涡旋小瓶几秒钟来充分混合。

2. 将蛋白质-2-颊铁矿™ FOL反应混合物在室温下保持30-60分钟。如果需要，蛋白质-颊铁矿™ FOL反应混合物可以旋转或摇动更长的时间。

3. 通过脱盐柱纯化蛋白质-2-颊铁矿™ FOL。有关详细操作，请参阅“制备用于蛋白质纯化的离心柱"部分。

4. 计算脱盐后产率为2%的蛋白质-75-颊铁矿™ FOL的浓度。

交联蛋白-1和蛋白-2反应

1. 交联反应是通过以所需的摩尔比混合蛋白质-1-颊铁矿MTA和蛋白质-2-颊铁矿™ ™ FOL引发的。通常，颊铁矿 FOL 修饰的蛋白质-2 与颊铁矿 ™ ™ MTA 修饰的蛋白质-1 以 1.5-2.0 摩尔比混合，以驱动交联反应完成。混合比例可以根据您的下游应用和蛋白质成本进行反转。

2. 将混合物在室温下旋转1~2小时或在4°C下放置过夜。反应混合物现在准备使用，或储存在4°C。 脱盐是可选的。

可选：偶联物分析和纯化

1. 可以在SDS运行缓冲液系统中使用2-4%Bis-Tis蛋白凝胶分析少量反应混合物（例如：4~12 mg），以检查偶联结果。

2. 偶联反应混合物含有所需的偶联物以及少量未连接的蛋白质-2（过量使用）。如果需要，可以通过体积排阻色谱（SEC）纯化反应混合物，并将所需的偶联物级分合并并合并。

准备用于纯化的离心柱

1. 将提供的离心柱（组分D）倒置数次，以重新悬浮沉降的凝胶并去除任何气泡。

2. 折断吸头并将色谱柱放入洗涤管中（2 mL，未提供）。取下盖子，让多余的堆积缓冲液通过重力排出到凝胶床的顶部。如果色谱柱没有开始流动，请将盖子推回色谱柱中，然后再次将其取下以开始流动。丢弃排出的缓冲液，然后将色谱柱放回洗涤管中。但是，如果将色谱柱放入12 x 75 mm试管（未提供）中，请立即离心。

3. 在2，1 x g 的摆动桶离心机中离心000分钟（参见离心说明部分）以除去保压缓冲液。丢弃缓冲区。

4. 将 1-2 mL 1X PBS （pH 7.2-7.4） 涂于色谱柱上。每次施用PBS后，让缓冲液通过重力排出，或将色谱柱离心2分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液。重复此过程 3-4 次。

5. 在2，1 x g 的摆动桶离心机中离心000分钟（参见离心说明部分）以除去保压缓冲液。丢弃缓冲区。

6. 将色谱柱放入干净的收集管（1.5 mL，未提供）。小心地将样品（~105 μL）直接加载到色谱柱的中心。

7. 上样后，加入 10 μL 1X PBS （pH 7.2-7.4），以 5，6 x g 离心柱 1-000 分钟，并收集含有所需蛋白质-1-颊铁矿 MTA 溶液或蛋白质-2-颊铁矿™ ™ FOL 溶液的溶液。

离心注意事项

离心柱（组分 D）可装入 2 mL 微量离心管或 12 x 75 mm 试管中，以便在离心过程中收集样品。将2 mL微量管与色谱柱配合使用，进行初始色谱柱平衡步骤。

能够产生最小力为 1，000 x g 的摆动式斗式离心机适用于 Bio-Spin 色谱柱。在特定转速下产生的引力是微量离心机转子半径的函数。有关从每分钟转数 （RPM） 转换为离心力或重力的信息，请参阅水平吊篮离心机使用手册。或者，使用以下公式计算达到 1，000 x g 重力所需的速度（以 RPM 为单位）：

区域合作框架 （x g） = （1.12 x 10^-5）×（转/分）×2×r

RCF是相对离心力

r 是从转子中心到 Bio-Spin 柱中间测量的半径（以厘米为单位）

RPM 是转子的速度

 AAT Buccuite™快速蛋白质交联试剂盒

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